Význam dehydroepiandrosteronu a jeho metabolitů v semenné tekutině pro mužskou sexualitu a reprodukci (2)
09.02.2010 19:09DHEA a sexuální funkce
Ve známé Massachusetts Male Aging Study v r. 1994 byla prokázána inverzní korelace mezi hladinami DHEA u starších mužů a jejich poruchami erektivity. Frekvence erektilních dysfunkcí u mužů s vyššími hladinami DHEA byla signifikantně nižší. Baulieu et al. (2000) při sledováni 280 žen a mužů ve věku 60-70 let, kterým podával 50 mg DHEA/den per os po dobu 1 roku zjistil, že kromě zlepšení stavu kůže (lepší hydratace, síla epidermis, produkce mazu a pigmentace) a zlepšeni kostního obratu u žen, byla signifikantně zvýšena sexuální apetence. Reiter a spol (1999) pacientům s různým typem erektilních dysfunkcí při normálním testosteronu, prolaktinu a PSA a hladinách DHEAS pod 1,5 mmol/l podával po dobu 6 měsíců DHEA, 50 mg/den p.o. a nalezl významné zlepšeni erektivity u mužů s hypertenzí a u erektilních dysfunkcí bez organické etiologie, nikoli však u diabetiků a mužů s neuropatií. Dehydroepiandrosteron a lidská sexualita Metabolity DHEA: degradační produkty nebo biologicky aktivní působky? Metabolické osudy DHEA(S) jsou dobře známy. Představuje jednu ze tří nejhojnějších složek močových 17-oxosteroidů. Močí je vylučován převážně jako sulfát. Kromě toho se v játrech konjuguje s kyselinou glukuronovou a jako glukosiduronát je rovněž močí vylučován. Část DHEA tvoří v periferii estery s mastnými kyselinami a ve steroidogenních tkáních slouží jako prekursor androgenů a následně estrogenů. Působením všudypřítomné oxidoreduktasy 17b-hydroxysteroidu ("17b-hydroxysteroidní dehydrogenasy") vzniká 5-androsten-3b,17b-diol (Kalimi a Regelson 2000, Hampl et al. 1997, Šonka 1976, Parker 1995). Vedle produktů těchto reakcí se v nezanedbatelných množstvích tvoří 7- a 16-hydroxyderiváty, přítomné v cirkulaci (Kalimi a Regelson 2000, Parker 1995). Dlouho byly považovány za pouhé degradační produkty. Nedávné práce však naznačily, že alespoň v případě 7-hydroxyderivátů jde o sloučeniny, zasluhující přinejmenším pozornost (Hampl et al. 1997, Morfin a Crouchay 1994). 7-Hydroxyderiváty DHEA: lokální účinné modulátory imunitní odpovědi? 7-Hydroxylace DHEA za vzniku 7a- a 7b- hydroxysloučenin je známa po víc než čtyři desetiletí. Enzymová aktivita odpovědná za tuto reakci byla prokázána u lidí i u experimentálních zvířat. Mohutná je v játrech a probíhá v řadě tkání včetně mozku (Morfin a Stárka 2001). Až donedávna byly však 7-hydroxyderiváty DHEA považovány za pouhé degradační produkty, bez biologické funkce. O to překvapivější jsou výsledky nedávných pokusů, dokládající, že právě 7a-hydroxydehydroepiandrosteron (7a-OH-DHEA) a v menší míře i jeho 7b-isomer a rovněž 7 -hydroxypregnenolon by mohl být lokálně účinným antiglukokortikoidem, odpovědným za aspoň některé imunostimulační a imunoprotektivní účinky připisované DHEA (Morfin a Crouchay 1994, Hampl et al. 1997). Samostatnou kapitolou je působení 7-hydroxyderivátů DHEA jako neurosteroidů. Jejich tvorbě v mozku a úloze v některých oblastech CNS byla věnována zvláštní kapitola v nedávné monografii o neurosteroidech (Morfin a Stárka 2001). Úloha steroidů a DHEA(S) jako modulátorů vnitřního prostředí Seminální tekutina jako jedinečné prostředí s duální rolí Steroidy v seminální tekutině Materiál a metody Soubor zdravých osob tvoří vedle dobrovolníků - dárců spermatu - zdraví muži, kteří navštívili ambulanci Sexuologického ústavu 1-LP UK v Praze, pro neplodnost, u nichž byla zjištěna příčina infertility jednoznačně na straně partnerky. Soubor nemocných tvoří pacienti Sexuologického ústavu s poruchami fertility a sexuálních funkcí. Konkrétně se jedná o následující diagnózy: snížená sexuální apetence (S-520), erektilní dysfunkce (S-522), neplodnost (N-460), vyšetřování plodnosti (Z-314). Analýzy prováděla laboratoř pod kódovými označeními. Stanovení steroidů v krevním séru a v semenné tekutině Pracovní protokol ke stanovení steroidů byl vypracován ve spolupráci Endokrinologického ústavu, oddělení steroidních hormonů (doc. RNDr R. Hampl) se Sexuologickým ústavem (MUDr. M. Pohanka) I. Stanovení v séru Testosteron Dihydrotestosteron Kortizol Dehydroepiandrosteron (DHEA) 7a- a 7b-Hydroxydehydroepiandrosteron Přesnost jako variační koeficienty paralelních a neparalelních stanovení je uvedena u každé metody, ostatní kriteria spolehlivosti, tj. správnost, citlivost a specificita jsou uvedena v původních citovaných pracích, v případě DHEA v příbalovém návodu k soupravě IMMUNOTECH. II. Stanovení v semenné tekutině Ejakuláty byly uchovávány zmrzlé při -70°C. Před analýzou byly vytemperovány na laboratorní teplotu, krátce (10 min) odstředěny při 1500 ot/min a supernatant použit k analýze. Postup souhrnně Jednotlivé kroky h = 5a/T, kde a.. radioaktivita 3H v podílu (200 ml) na stanovení ztrát Kapalinová chromatografie (HPLC) Frakce ve skleněných mikrozkumavkách byly odpařeny na vakuové centrifugační odparce a alikvoty požity ke konečnému stanovení pomocí radioimunoanalýzy. Radioimunoanalýza Všechna následující stanovení byla prováděna v duplikátech. Stanovení 7a-a 7b-Hydroxydehydroepiandrosteronu (7a- a 7b-OH-DHEA) C7OH = b.0,0345/h Stanovení dehydroepiandrosteronu (DHEA) CDHEA = 10 c/h.288 Stanovení kortizolu Ckort = d. 0,55/h Stanovení testosteronu Ctesto = 10.e/h.288 Stanovení dihydrotestosteronu CDHT = 10f/h.290 Závěr Jde o první systematickou studii, zda jsou přítomny a jakou úlohu hrají imunomodulačně působící steroidy v semenné tekutině a nakolik se uplatňují v patogenezi mužské infertility a sexuálních dysfunkcí. Výsledky jsou odpovědí na to, zda se liší poměr imunomodulačně a imunosupresivně působících steroidů a dalších faktorů u zdravých mužů a u pacientů s poruchou fertility resp. sexuálních funkcí. Výsledky nepřímo přispívají k diskutované otázce náhradní steroidní terapie DHEA u mužů a navazují tak na v současnosti probíhající pokus s podáváním DHEA a jeho 7-oxoderivatu mužům. MUDr. Michal Pohanka
První upozornil v r. 1973 na vztah mezi zásobením dehydroepiandrosteronem a sexualitou Borghi, když popsal změny sexuálního chování u dospělého muže s adrenální hyperprodukci DHEA. Pokud však hladiny dehydroepiandrosteronu a dalších androgenů (androstendionu, testosteronu a dihydrotestosteronu) jsou v rozmezí běžném pro dané věkové hladiny, nebyly u mladších ani starších žen zjištěny žádné korelace mezi stupněm sexuální apetence, sexuálním uspokojením nebo četností pohlavního styku (Persky et al., 1982). Poněkud odlišná byla situace u žen se sekundárními poruchami sexuálni responzivity. U nich po několikaměsíčním podáváni dehydroepiandrosteronu bylo dosaženo zlepšeni v 17 případech z 26 pacientek. V jiné podobné studii (Guay 2001) na ženách se sníženou apetencí a abnormálně nízkým cirkulujícím testosteronem bylo dosaženo normální sexuální apetence nebo alespoň částečného zlepšení v 7 případech z 8 po podáváni 50-100 mg DHEA denně. Skutečnost, že terapeutický význam má teprve dlouhodobější podáváni DHEA potvrzuje i novější metaanalýza ( Huppert et a1., 2000), která rozebirá výsledky z celkem 415 zpráv o vlivu podávání DHEA nebo DHEAS na pocit pohody a dochází k závěru, že pozorovatelné zlepšeni "well-being" nebo kognitivnich funkcí lze prokázat až po několikaměsíčni aplikaci steroidu.
V této souvislosti je pozoruhodná práce Cawoodova a Bancroftova (1996), která sledovala vliv komplexu faktorů na pocit pohody a na sexualitu u 141 žen. Měřena byla při tom i celá škála hormonálních ukazatelů, žádný z hormonů však nebyl prediktorem úrovně sexuality, kdy byly spíše určujícími faktory kvalita partnerského vztahu, postoje k sexualitě a ukazatele pocitu pohody. Bylo však prokázáno, že jediným pozitivně korelujícím hormonálním parametrem s pocitem dobré pohody byly hladiny kolujícího DHEA(S).
Vliv suplementace DHEA (většinou 50 mg/den) byl studován na representativních skupinách žen, ať již v perimenopauze (Morales et al. 1994, Bamhart et al. 1999), na ženách ve vyšších věkových skupinách (Baulieu et al. 2000), pacientkách s adrenální nedostatečností (Arlt et al.1999, 2000) nebo s HIV pozitivitou (Ggoggin et al. 1998). Práce se většinou ( výjimkou je studie Barnhartova 1999) shodují v tom, že DHEA významně zlepšuje pocit psychické a fyzické pohody a že nemá nežádoucí vedlejší účinky a že zlepšení libida bylo nápadnější tam, kde byly výchozí hladiny DHEA zřetelně podnormální. Tak u žen s adrenální insuficiencí DHEA zvyšoval vysoce významně frekvenci sexuálních představ, zájmu o sex a uspokojeni jak s mentální, tak fyzickou stránkou sexuality.
Poněkud méně je studií u mužů. Pokud byly provedeny, jsou zaměřeny na vyšší věkové skupiny (Morales et al. 1994, Baulieu et al 2000, Arit et al. 2001). Vliv na pocit dobré pohody při suplementaci DHEA byl u mužů o něco méně výrazný než u srovnatelných skupin žen (ve studii Moralesově 1994 u zlepšeni u 67% mužů a 84% žen) a rovněž sexuální apetence se zlepšovala pokud vůbec - spíše u žen než u mužů. U mladších zdravých dobrovolníků na rozdíl od pacientůs adrenálni insuficiencí zlepšení sexuality po DHEA nebylo pozorováno (Arit et al. 2001).
Poněkud stranou stojí pozorováni Dornerovo (1991), který při ověřování své teorie o stresových vlivech na genezi homosexuality zjistil, že u homosexuálních mužů jsou zvýšeny hladiny DHEAS a poměr DHEAS k androstendionu v bazálních i ACTH stimulovaných hodnotách. Významně zvýšené byly i hladiny DHEAS u transsexuálů male-to-female.
Příznivý vliv léčby dehydroepiandrosteronem na některé typy poruch erektivity popsal Reiter a spol. (1999)
v lidské semenné tekutině
Svým složením představuje semenná tekutina jedinečné prostředí, umožňující průnik spermie přes zona pellucida oocytu s následujícím potlačením imunitní reakce příjemce a současně chránící mužské zárodečné buňky.
Z imunologického hlediska zde hrají významnou úlohu přítomné cytokiny, produkované různými buňkami urogenitálního traktu, včetně samotných spermatozoí a seminálních leukocytů. Obě subpopulace T-lymfocytů (Th1 i Th2) produkující cytokiny i jejich receptory byly zjištěny v ejakulátu a byl prokázán vztah mezi jejich skladbou a fertilitou resp. infertilitou (Gruschwitz et al. 1996, Dousset et al. 1997). Prostaglandiny, další charakteristická složka semenné tekutiny, mohou mj. modulovat cytokiny zprostředkovanou imunitní odpověď ve smyslu neodmítnutí spermatických antigenů ženským reprodukčním systémem (Kelly a Critchley, 1997).
Jak ve spermatozoích, tak seminálních leukocytech, se tvoří reaktivní kyslíkaté sloučeniny (reactive oxygen species, ROS), nezbytné pro klíčové biologické pochody při oplodnění, konkrétně pro akrosomální reakci a navození hypermotility spermií (Sharma a Agarwal 1996). Díky přítomným enzymům, odpovědným za tvorbu i likvidaci (scavenging) ROS je doba existence ROS, vyjádřená jejich poločasem, dostatečně krátká, aby na jedné straně splnily svoji úlohu a na druhé straně nepoškozovaly zárodečné buňky. Je známo, že nadbytečná tvorba ROS v semenné tekutině, která může vyústit až v oxidační stres, je častou příčinou infertility (Ochsendorf 1999, Aitken 1995, Conte et al. 1999). Tvorbu ROS a jejich likvidaci opět ovlivňují cytokiny (Depuydt et al. 1996).
Vedle cytokinů, prostaglandinů, růstových faktorů a řady dalších signálních a jiných sloučenin, obsahuje seminální tekutina i steroidy. Od poloviny 70. let byly v semenné tekutině prokázány hlavní androgeny, dihydrotestosteron a testosteron a některé jejich prekurzory, konkrétně pregnenolon a dehydroepiandrosteron a jejich sulfáty, estrogeny (Shirai et al.1975, Le Lannou et al. 1980, Asch et al. 1984, 1995) a později i progesteron a kortizol (Abbaticchio et al. 1981). Většina studií zabývajících se steroidy v semenné tekutině se týkala androgenů a v menší míře estrogenů ve vztahu k poruchám mužské reprodukce, především abnormalitám spermiogramu, k poruchám sexuálních funkcí a fertility (Asch et al. 1984, 1995, Purvis et al. 1975, De Aloysio et al. 1978, Bujan et al. 1993). Výsledky většinou nebyly jednoznačné.
V souvislosti s nedávným poznáním imunomodulačních a imunoprotektivních účinků dehydroepiandrosteronu, vysvětlovaných jeho negenomovým antiglukokortikoidním působením (Kalimi et al. 1984), se nabízí otázka, jakou úlohu hraje tento steroid, přítomný v seminální tekutině spolu s kortizolem, při udržování optimálního imunitního prostředí. V tomto ohledu je zajímavý i nedávný průkaz, že v ejakulátu (Hampl et al. 2000) se nacházejí 7-hydroxylované metabolity DHEA, považovaných dnes za lokálně účinné antiglukokortikoidy. Množí se důkazy, že právě 7-hydroxylované metabolity DHEA mohou býti para- či autokrinně účinnýmí látkami, lokálně vyrovnávajícími neúměrné účinky glukokortikoidů, aniž by přitom potlačovaly jejich vitální funkce (Morfin a Crouchay 1994, Lafaye et al. 1999). V této souvislosti není bez zajímavosti, že v ejakulátu byla zjištěna jako jeden z nemnoha enzymů steroidního metabolismu dehydrogenáza 11b-hydroxysteroidů, hojná mj. v Leydigových buňkách, katalyzující přeměnu kortizolu na neaktivní kortizon (Nacharaju et al. 1997).
DHEA a jeho metabolity mění skladbu cytokinů ve prospěch "protizánětlivých" interleukinů (Kalimi et al. 1994) a nadto významně ovlivňují i tvorbu ROS (Yamada et al. 1994, Swierczynski et al. 1996).
Jakkoli existuje řada dokladů o steroidech v seminální tekutině, z hlediska vztahu k imunitě, konkrétně možného ovlivnění imunitního prostředí, úlohu steroidů v semenné tekutině nikdo dosud nestudoval.
V ejakulátu byly stanoveny následující steroidy: testosteron, dihydrotestosteron, DHEA, kortizol, oba isomery 7-0H-DHEA, případně i estradiol. V krevním séru byly vedle uvedených steroidů stanovovány ještě DHEAS, gonadotropiny a prolaktin.
K izolaci steroidů z biologického materiálu bylo využito extrakce a roztřepávání do organických rozpouštědel, případné další přečištění pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografiie, ke konečnému stanovení pak originalních imunoesejí, a kitových metod. K jednoznačnému průkazu steroidů v ejakulátu po přečištění vzorků bylo použito systému GC-MS. Paralelně s ejakulátem byly vyšetřovány hladiny uvedených látek a prolaktinu v séru.
byl stanoven radioimunoanalýzou (RIA) (Hampl 1994) po extrakci diethyletherem s využitím antiséra vůči testosteron-3-0-(karboxymethyloximu):BSA a radiojodem značeného homologního derivátu s tyrosinmethylesterem. K dávkování činidel bylo využito analyzátoru STRATEC (lmmunotech, Praha).
Intraassay CV=8.2%, Interassay CV=10.7%
byl stanoven RIA metodou podle (Hampl et al. 1990), po extrakci diethyletherem a následné oxidaci zkříženě reagujících steroidů manganistanem draselným. Jako činidel bylo použito dihydrotestosteron- 3-0-(karboxymethy loximu):BSA a [3H]dihydrotestosteronu (Radiochemical Center, Amersham, Anglie).
Intraassay CV=8.7%, Interassay CV=12.1 %
byl stanoven bezextrakční RIA metodou podle (Bičíková et al. 1988), s využitím antiséra vůči kortizol-3-0-(karboxymethyloximu):BSA a radiojodem značeného homologního derivátu s tyrosinmethylesterem. Protilátka byla navázána na stěny zkumavek, používaných v analyzátoru STRATEC.
Intraassay CV=5.2%, Interassay CV=9.8%
byl stanoven RlA po extrakci diethyletherem s použitím komerční soupravy IMMUNOTECH (Francie-ČR).
Intraassay CV=7.2%, Interassay CV=11.9%.
byly stanoveny RIA podle (Lapčík et al. 1998, 1999), po extrakci do diethyletheru, s využitím antisér vůči 19-0-(karboxymethyloximů):BSA a radiojodem značených homologních derivátů s tyrosinmethylesterem.
7a-Hydroxydehydroepiandrosteron: Intraassay CV=7.1%, Interassay CV=10.6%.
7b-Hydroxydehydroepiandrosteron: Intraassay CV=6.7%, Interassay CV=10.0%.
Vlastní postup analýzy sestával z následujících kroků: extrakce do diethyletheru, odpaření extraktu, roztřepávání mezi vodu-methanol-n-hexan (k oddělení tukovitých složek), odpaření vodno-methanolické vrstvy, separace steroidů pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v gradientovém uspořádání, sběr frakcí obsahujících jednotlivé stanovované steroidy, odpaření eluentu a radioimunoanalýza jednotlivých steroidů pomocí specifických RIA. Ztráty během extrakce a roztřepávání byly monitorovány pomocí přidaného [3H]11b-hydroxyandrostendionu. Jednotlivé kroky pro případ 7a- a 7b-hydroxydehydroepiandrosteronu jsou popsány v (Hampl et al. 2000).
Extrakce a roztřepávání
K 1 ml semenné tekutiny bylo přidáno známé množství (okolo 40 000 dpm) [3H]11b-hydroxyandrostendionu, připraveného oxidací [1,2,6,7-3H]kortizolu "Radiochemical Center, Amersham, Anglie) vizmutičňanem sodným podle (Putz et al. 1987). Vzorky byly vytřepány na vibračním míchadle 1 min nejprve 4 a poté, po oddělení extraktu, ještě 2 ml diethyletheru. K oddělení vodné a organické vrstvy bylo použito vymrazení spodní vrstvy v lázni se suchým oxidem uhličitým. Etherové extrakty byly spojeny a odpařeny dosucha. K odparkům bylo přidány 2,5 ml methanolu, 2 ml vody a 0,5 ml n-hexanu (vše čistoty pro analysi). Směs byla protřepána na vibračním míchadle 1 min a po rozdělení fází byla vrchní vrstva opatrně odsáta pomocí Pasteurovy pipety. Spodní vrstva, obsahující stanovované steroidy, byla odpařena dosucha na vakuové centrifugační odparce ("speed-vac centrifuge"). Odparky byly rozpuštěny v 1 ml 96% ethanolu, 200 ml bylo přeneseno do scintilačních nádobek se 4 ml scintilačního roztoku na zjištění ztrát, zbytek byl kvantitativně přenesen do speciálních nádobek pro kapalinovou chromatografii, ve kterých byl odpařen pod proudem dusíku. Účinnost extrakce a roztřepávání (h) byla vypočtena podle vzorce:
T .. je celková průměrná přidaná radioaktivita [3H]11b-hydroxyandrostendionu,
Separace steroidů pomocí HPLC byla prováděna na stavebnicovém systému GILSON (Villiers le Bel, France), tvořeného master pumpou 305 s manometrickým modulem 805, pomocnou pumpou ("slave pump") 306, dynamickým mixérem 811C, autoinjektorem 234 a jímačem frakcí FC 203B. UV detektor LCD 2082 a kolonová pec LCO 100 byly od výrobce ECOM (ČR). Kolona s reverzní fází ET 250/4 NUCLEOSIL@ 100-5 C18 byla od výrobce MACHEREY-NÄGEL (SRN). K řízení, monitorování a vyhodnocení bylo použito software CSW APEX system (DataApex, CR). Rozpouštědla použitá pro dělení byla kvality pro HPLC.
Vzorky (odparky) byly rozpuštěny v 70 ml methanolu, 25 ml tohoto roztoku, odpovídající 286 ml semenné tekutiny, bylo aplikováno na HPLC. Jako mobilní fáze bylo použito dvou složek v lineárnim gradientovém uspořádání: Složka A = 15% vodný roztok acetonitrilu obsahující 100 mg/l hydrouhličitanu amonného, složka B = methanol. Gradient spočíval v proměnném zastoupení jednotlivých složek. Konkrétně se poměr složky A:B měnil následovně: 1.:A=0, B=1; 2. A=5, B=10; 3. A=50, B=6; 4. A=50, B=9, při průtokové rychlosti 1 ml/min. Ostatní podmínky: detekce standardů v u.v. při 205 nm, teplota 40 T (izotermické dělení).
Jednotlivé frakce byly jímány podle retenčních časů (Rt) autentických standardů následovně:
Frakce 1., Rt = 8,4-8,9 min, 7b-Hydroxydehydroepiandrosteron
Frakce 2., Rt = 8,9-9,4 min, Kortizol
Frakce 3., Rt = 9,4-9,9 min, 7b-Hydroxydehydroepiandrosteron
Frakce 4., Rt = 14,0-14,5 min, Testosteron
Frakce 5., Rt = 14,7-15,2 min, Dehydroepiandrosteron
Frakce 6., Rt = 15,2-15,8 min, Dihydrotestosteron
Oba isomery 7-0H-DHEA byly stanoveny stejně. Roztoky standardů a ostatní činidla byly stejné, jako při stanovení v séru. Odparky po rozdělení na HPLC byly rozpuštěny ve 300 ml pufru, používaného na RIA (20 mmol/l sodnofosfátový pufr, pH 7,2, obsahující 1 g/l azidu sodného, 1 g/l BSA a 9 g/ NaCl). Současně byly připraveny roztoky standardů, obsahující 0,3.125,6.25, 12.5,25, 50 a 100 pg/100 ml obou isomerů 7-OH-DHEA (nulový bod a 6 hodnot standardní řady). Do polystyrenových zkumavek byly postupně dávkovány roztoky vzorků nebo standardů (po 100 ml), radioligandů a antisér (rovněž po 100 ml), do zkumavek pro nulový bod kalibrace a na stanovení nespecifické vazby byl namísto vzorů či standardů dávkován pufr, do vzorku pro stanovení nespecifické vazby a na stanovení celkové radioaktivity byl namísto antiséra rovněž dávkován pouze pufr. Po promíchání a inkubaci přes noc při 4°C bylo k vzorkům přidáno 500 ml míchané, vychlazené suspenze aktivního uhlí s dextranem (0.25 a 0,025 % ), obsah byl promíchán na vibračním míchadle a po 10 min v chladnici byly vzorky zcentrifugovány při 3000 ot/min 10 min. Supernatant byl slit do další sady polystyrenových zkumavek a změřena radioaktivita 125I na dvanáctikanálovém měřiči BERTHOLD (SRN). Z kalibrační závislosti v log-logitovém výnosu byla vypočteno množství analytu ve zpracovaném objemu semenné tekutiny v pg. (b).
Obsah obou isomerů 7-OH-DHEA (C70H) v nmol/l byl vypočten podle vzorce:
Odparky po rozdělení na HPLC obsahující DHEA byly rozpuštěny ve 286 ml pufru, dodávaného v soupravě IMMUNOTECH spolu se zkumavkamí s navázanou protilátkou, standardními roztoky a radioligandem. Do zkumavek bylo dávkováno po 100 ml roztoků vzorků nebo standardů (0, 50, 100, 300, 1000 a 3000 pg/1O0 ml) a radioligand (500 ml). Po 1 h inkubaci byl roztok odsát a ve zkumavkách byla změřena radioaktivita 125I. K inkubaci, odsátí roztoku, změření radioaktivity a pro výpočet bylo použito analyzátoru STRATEC (program 100 - "no pipetting"). Hodnoty vypočtené přístrojem (c) byly v pg/zkumavku. Obsah DHEA (CDHEA) v nmol/l byl vypočten podle vzorce:
Odparky po rozdělení na HPLC obsahující kortizol byly rozpuštěny v 1700 ml pufru, používaného na RIA kortizolu v séru (20 mmol/l citrát-fosfátový pufr pH 4,0). 30 ml Roztoků vzorků nebo standardů (řada obsahující 0, 16.3, 40.8, 81.6, 163, 326, 652 a 1304 pg kortizolu ve 30 ml pufru) bylo dávkováno do plastových zkumavek, potažených protilátkou vůči kortizol-3-0(karboxymethyloximu):BSA, připravených v laboratoři. Po 1 h inkubaci byl roztok odsát a ve zkumavkách byla změřena radioaktivita 125I. K dávkování, inkubaci, odsátí roztoku, změření radioaktivity a pro výpočet bylo použito analyzátoru STRATEC (program "kortizol"), používaný pro stanovení v séru. Hodnoty vypočtené přístrojem (d) v pg/zkumavku byly přepočteny na obsah kortizolu v nmol/l (Ckort) podle vzorce:
Odparky po rozdělení na HPLC obsahující testosteron byly rozpuštěny v 286 ml pufru, používaného na RIA. Do analýzy bylo bráno 100 ml. Činidla (standardy, radioligand a antisérum) byla stejná, jako u stanovení v séru. Do polysterenových zkumavek byly postupně dávkovány roztoky vzorků nebo standardů (po 100 ml), radioligandu a antiséra (po 100 ml), do zkumavek pro nulový bod kalibrace a na stanovení nespecifické vazby byl namísto vzorů či standardů dávkován pufr, do vzorku pro stanovení nespecifické vazby a na stanovení celkové radioaktivity byl namísto antiséra rovněž pouze pufr. Standardní řadu tvořila sada obsahující 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 a 100 pg testosteronu na zkumavku. Po promíchání a inkubaci přes noc při 4°C bylo k vzorkům přidáno 500 ml míchané, vychlazené suspenze aktivního uhlí s dextranem (0.25 a 0,025%), obsah byl promíchán na vibračním míchadle a po 10 min v chladnici byly vzorky zcentrifugovány při 3000 ot/min 10 min. Supernatant byl slit do další sady polystyrenových zkumavek a změřena radioaktivita 1251 na dvanáctikanálovém měřiči BERTHOLD (SRN). Z kalibrační závislosti v log-logitovém výnosu byla vypočteno množství analytu ve zpracovaném objemu semenné tekutiny v pg (hodnota e). Koncentrace testosteronu v nmol/l (Ctesto) byla vypočtena podle vzorce:
Odparky po rozdělení na HPLC obsahující dihydrotestosteron byly rozpuštěny v 286 ml pufru, používaného na RIA. Do analýzy bylo bráno 100 ml. Činidla (standardy, radioligand a antisérum) byla stejná, jako u stanovení v séru. Do polysterenových zkumavek byly postupně dávkovány roztoky vzorků nebo standardů (po 100 ml), radioligandu a antiséra (po 100 ml), do zkumavek pro nulový bod kalibrace a na stanovení nespecifické vazby byl namísto vzorů či standardů dávkován pufr, do vzorku pro stanovení nespecifické vazby a na stanovení celkové radioaktivity byl namísto antiséra rovněž pouze pufr. Standardní řadu tvořila sada obsahující 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 a 200 pg dihydrotestosteronu na zkumavku. Po promíchání a inkubaci přes noc při 4°C bylo k vzorkům přidáno 500 ml míchané, vychlazené suspenze akt. uhlí s dextranem, obsah byl promíchán na vibračním míchadle a po 10 min v chladnici byly vzorky zcentrifugovány při 3000 ot/min 10 min. Supernatant byl slit do scintilačních nádobek obsahujích 4 ml scintilačniho roztoku a byla v nich změřena radioaktivita 3H v kapalinovém scintilačním spektrometru BECKMAN (USA). Z kalibrační závislosti v log-logitovém výnosu byla vypočteno množství analytu ve zpracovaném objemu semenné tekutiny v pg. (hodnota f). Koncentrace testosteronu v nmol/l (CDHT) byla vypočtena podle vzorce:
Studie je dlouhodobá a definitivní výsledky přinese další vydání Andrologie.
Fakultní nemocnice Brno
—————
